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| Titel: | Identifizierung neuer genetischer Faktoren der Atherosklerose am Modell atheroskleroseresistenter und atheroskleroseempfindlicher Kaninchen |
|---|---|
| Von: |
eingereicht von: Ralph Burkhardt
|
| Person: |
Burkhardt, Ralph
1976- Verfasser aut |
| Hauptverfasser: | |
| Format: | Buch |
| Sprache: | Deutsch |
| Veröffentlicht: |
2005
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| Beschreibung: | Leipzig, Univ., Diss., 2005 |
| Umfang: | 143 Bl. Ill., graph. Darst. |
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INHALTSVERZEICHNIS
1. EINLEITUNG 1
1.1 Risikofaktoren der koronaren Herzerkrankung 1
1.2 Pathogenese der Atherosklerose 4
1.2.1 Endotheliale Dysfunktion 4
1.2.2 Retention extrazellulärer Lipide in der Gefäßwand 5
1.2.3 Zelladhäsion und Rekrutierung von Leukozyten 6
1.2.4 Cholesterin Homöostase und Schaumzellbildung 8
1.2.5 Progression der atherosklerotischen Läsion und Inflammation 10
1.2.6 Plaque Ruptur 12
1.3 Experimentelle Untersuchungen zur Genetik der Atherosklerose 14
1.3.1 Untersuchungen beim Menschen 14
1.3.2 Untersuchungen am Mausmodell 16
1.3.3 Genetische Atherosklerosedisposition bei hypercholesterinämischen
HAR und LAR Kaninchen 17
1.4 Problemstellung der Arbeit 20
2. METHODEN 21
2.1 Tierexperimentelle Arbeiten 21
2.1.1 HAR und LAR Kaninchen 21
2.1.2 Blutentnahme 21
2.1.3 Isolierung von Peritonealmakrophagen 22
2.1.4 Organentnahme 22
2.2 Biochemische Methoden 23
2.2.1 Lipidanalytik 23
2.2.2 Messung der Arginaseaktivität 23
2.2.3 Proteinbestimmung 24
2.3 Molekularbiologische Methoden 24
2.3.1 RNA Isolation aus Makrophagen 24
2.3.2 RNA Isolation aus der Gefäßwand 25
2.3.3 Isolation von poly A+ RNA (mRNA) 26
2.3.4 Reverse Transkription 26
2.3.5 Isolation von genomischer DNA 27
Inhaltsverzeichnis
2.3.6 Polymerase Kettenreaktion (PCR) 27
2.3.7 Klonierung von PCR Produkten 27
2.3.8 Präparation von Plasmid DNA (Plasmid Mini Präparation) 28
2.3.9 Reinigung von Nukleinsäuren durch Phenolextraktion 29
2.3.10 Ethanolpräzipitation von Nukleinsäuren 30
2.3.11 Bestimmung der Konzentration von Nukleinsäuren 30
2.3.12Agarose Gelelektrophorese 30
2.3.13 DNA Sequenzierung 31
2.3.14 Subtraktive Hybridisierung 31
2.3.15 Differential Screening Untersuchung 37
2.3.16 Northern Blotzur Bestimmung der Arginase I mRNA Expression 39
2.3.17 Quantitative RT PCR 40
2.3.17.1 Herstellung von Primer und Sonden für die TaqMan RT PCR 42
2.3.17.2 Herstellung von cDNA für die TaqMan Standardkurven 44
2.3.17.3 Präparation von Plasmid DNA (Plasmid Maxi Prep) 44
2.3.17.4 Linearisierung und Quantifizierung der Plasmid DNA 45
2.3.17.5 Messung der Proben im ABI Prism 7700 Sequence Detector 46
2.3.18 Rapid Amplification of cDNA Ends (RACE) 47
2.3.19 Vergleichende Sequenzierung der Arginase I cDNA bei
HAR und LAR Kaninchen 49
2.3.20 BAC Library Screening und Sequenzierung der Arginase I
Promotorsequenz 50
2.3.21 Bioinformatik 52
2.4 Material 53
3. ERGEBNISSE 58
3.1 Diätinduzierte Hypercholesterinämie bei HAR und LAR Kaninchen 58
3.2 Untersuchung bekannter Kandidatengene der Atherosklerose 59
3.2.1 CD36 59
3.2.2 Monocyte Chemoattractant Protein 1 (MCP 1) 63
3.2.3 lnterleukin 6 (IL 6) 64
3.3 Identifizierung differentiell exprimierter Gene in Makrophagen 65
3.4 Identifizierung differentiell exprimierter Gene in der Aorta 70
3.5 Quantitative mRNA Expression identifizierter Gene in Makrophagen....73
Inhaltsverzeichnis
3.6 Charakterisierung von Arginase I in HAR und LAR Kaninchen 78
3.6.1 Untersuchung der Arginase Enzymaktivität in Makrophagen 78
3.6.2 Organexpression von Arginase I in HAR und LAR Kaninchen 79
3.6.3 Northern Blot Analyse der Arginase I mRNA Expression 80
3.6.4 Identifizierung des Arginase I Transkriptionsstarts und der
füll length cDNAin HAR und LAR Kaninchen 81
3.6.5 Abhängigkeit der Arginase I mRNA Expression vom
Arginase Längenpolymorphismus 86
3.6.6 Sequenzierung und Analyse der Arginase I Promotorregion 87
3.6.7 Arginase I Haplotypen und mRNA Expression 95
4. DISKUSSION 97
5. ZUSAMMENFASSUNG 116
6. LITERATURVERZEICHNIS 118
7. GLOSSAR 136
8. LEBENSLAUF 139
9. VERÖFFENTLICHUNGEN 140
10. DANKSAGUNG 143
11. ERKLÄRUNG ÜBER DIE EIGENSTÄNDIGE ABFASSUNG
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