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| Title: | Die Suche nach Inhibitoren der Histonmethyltransferase Su(var)3-9 aus Drosophila melanogaster |
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von Dorothea Elisabeth Greiner
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| Person: |
Greiner, Dorothea Elisabeth
1979- Verfasser aut |
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2008
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| adam_text | jV Inhaltsverzeichnis
1 Einleitung 1
1.1 Die Organisation der DNA im Zellkern 1
1.2 Was ist Epigenetik? 5
1.2.1 Heterochromatin und Euchromatin 6
1.2.2 Histonmodifikationen 9
1.2.2.1 Methylierung 10
1.2.2.2 SU(VAR)3-9 l9
1.2.2.3 Acetylierung 22
1.2.3 DNA-Methylierung 24
1.2.4 Imprinting 25
1.2.5 Epigenetisches Zusammenspiel: Ein Histon-Code? 26
1.3 Epigenetik im Kontext menschlicher Erkrankungen 29
1.3.1 Pränatale Periode 29
1.3.2 Immunsystem und Autoimmunerkrankungen 30
1.3.3 Neurologie und Neuropsychiatrie 31
1.4 Rolle der Epigenetik in der Kanzerogenese 34
1.4.1 DNA-Methylierung in Tumoren 35
1.4.2 Histonacetylierung in Tumoren 36
1.4.3 Die Bedeutung von Histonmethyltransferasen 38
1.5 Modulatoren der Epigenetik: Epigenetische Therapeutika? 44 j
1.5.1 DNA-Methyltransferase-Inhibitoren 44 j
1.5.2 Histondeacetylase-Inhibitoren 46
I
2 Zielsetzung 47
3 Material und Methoden 48
3.1 m aterial 48
3.1.1 Verbrauchsmaterialien 48
3.1.2 Chemikalien und Enzyme 49
3.1.3 NaturstofT-Bibliothek 49
3.1.4 Medien 50
3.1.5 Verwendete Bakterienstämme und eukaryotische Zelllinien 50
3.1.6 Verwendete Fliegenstämme 51
3.1.7 DNA-Konstrukte 52
Inhaltsverzeichnis V
3.1.8 Antikörper 53
3.1.9 Geräte 53
3.2 Methoden 55
3.2.1 Arbeiten mit Proteinen 55
3.2.1.1 Protein-Analyse mittels SDS-PAGE 55
3.2.1.2 Färbung von Proteingelen mit Coomassie-Blau 56
3.2.1.3 Konzentrationsbestimmung von Proteinen 57
3.2.2 Transformation chemisch kompetenter Escherichia coli 57
3.2.3 Expression von Histonmethyltransferasen inBL-21 58
3.2.3.1 His-tag 58
3.2.3.2 Intein-tag 60
3.2.3.3 GST-tag 61
3.2.4 HIM-Assay/HMT-Assay 63
3.2.4.1 „Spot-and-count -Methode 63
3.2.4.2 Autoradiographische Methode 65
3.2.4.3 Massenspektrometrische Methode 65
3.2.5 Zellkultur 66
3.2.6 Proteinexpression von E(z)-Komplex im Baculo-System 67
3.2.7 Behandlung von Zellen mit Chaetocin 69
3.2.8 Zellwachstumsassay 69
3.2.9 Saure Extraktion von Histonen 70
3.2.10 Massenspektrometrie 72
3.2.10.1 Propionylierung und Trypsinverdau 72
3.2.10.2 Peptidextraktion 73
3.2.10.3 Zip-Tip-Präparation 73
3.2.11 Western Blot 75
3.2.12 Fliegenhaltung 77
3.2.13 Behandlung von Fliegen mit Chaetocin 77
4 Ergebnisse 78
4.1 Modulatoren der Histonmethyltransferase SU(VAR)3-9 78
4.2 Wirkung von Chaetocin auf verschiedene
Histonmethyltransferasen in vitro. „. ....... . . 84
VI Inhaltsverzeichnis
4.2.1 Chaetocin hemmt Drosophila melanogaster SU(VAR)3-9 delta 213
und Wildtyp 84
4.2.2 Chaetocin hemmt SU(VAR)3-9 kompetitiv 87
4.2.3 Chaetocin hemmt auch nach Spaltung seiner Disulfidbrücken SU(VAR)3-9 90
4.2.4 Das menschliche SU(VAR)3-9-Ortholog SUV39H1 wird durch Chaetocin
gehemmt 92
4.2.5 Wirkung von Chaetocin auf die nicht für Histon H3 Lysin 9 spezifischen
Methyltransferasen E(z)-Komplex, PR-SET7 und SET7/9 94
4.2.6 Chaetocin hemmt G9a und DIM-5 erst in höheren Konzentrationen 96
4.3 Wirkung Von Chaetocin In Vivo 98
4.3.1 Zelldichteabhängige Toxizität von Chaetocin 98
4.3.2 Effekte von Chaetocin auf Histonmodifikationen 100
4.3.3 Effekte von Chaetocin auf Drosophila melanogaster Fliegen 105
5 Diskussion 107
5.1 Diskussion der Methoden 107
5.1.1 Screening der Naturstoffbibliothek 107
5.1.2 Spot and Count Assay verschiedener Histonmethyltransferasen mit Chaetocin.. 110
5.1.3 In vivo Testung von Chaetocin an SL2-Zellen 111
5.2 Diskussion der Ergebnisse 112
5.2.1 Modulatoren von SU(VAR)3-9 112
5.2.2 Spezifität von Chaetocin: Hemmung von SU(VAR)3-9 oder Hemmung der
Methylierung von Histon H3-K9? 114
5.2.3 Kompetitive Hemmung von SU(VAR)3-9 durch Chaetocin 116
5.2.4 Zelldichteabhängige Toxizität von Chaetocin 119
5.2.5 Effekte von Chaetocin auf die Methylierung von Histon H3 120
5.3 Ausblick 121
5.3.1 Effekte von Chaetocin auf Drosophila melanogaster ln(l)wm4/Su(var)3-9/+ 121
5.3.2 Die Bedeutung von Chaetocin als wissenschaftliches Hilfsmittel oder
zukünftiges Medikament 122
6 Zusammenfassung .. . .. . ...... 125
7 Literaturverzeichnis .................. .. .. 127
Inhaltsverzeichnis vn
8 Abkürzungsverzeichnis 155
9 Danksagung 157
10 Anhang 159
Publikation
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