Gespeichert in:
| Titel: | Isolierung und Charakterisierung von multipotenten nichthämatopoetischen Stammzellen aus murinem Knochenmark |
|---|---|
| Von: |
vorgelegt von Andreas Heider
|
| Person: |
Heider, Andreas
1982- Verfasser aut |
| Hauptverfasser: | |
| Format: | Hochschulschrift/Dissertation Elektronisch Software E-Book |
| Sprache: | Deutsch |
| Veröffentlicht: |
2013
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| Umfang: | 203 S. Ill., graph. Darst. 12 cm |
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1 ZUSAMMENFASSUNG 7
2 SUMMARY 11
3 EINLEITUNG 15
3.1 STAMMZELLEN, ALLGEMEIN 15
3.2 ADULTE STAMMZELLEN IN MURINEM KNOCHENMARK 18
3.2.1 HSC 18
3.2.2 EPC 20
3.2.3 MSC 21
3.2.3.1 ENTDECKUNG 21
3.2.3.2 DAS CFU-F EXPERIMENT VON FRIEDENSTEIN ET AL 22
3.2.3.3 EXISTENZ TRANSPLANTIERBARER MSC 22
3.2.3.4 VERLUST VON STAMMZELLEIGENSCHAFTEN DURCH KULTIVIERUNG 23
3.2.3.5 KLINISCHE ANWENDUNGEN 24
3.2.3.6 DIFFERENZIERUNGSWEGE VON MSCS 25
3.3 MULTI-LINIEN POTENTIAL ADULTER STAMMZELLEN UND PLASTIZITAET 29
3.3.1 ZELLTYPEN MIT POSTULIERT-PLURIPOTENTEN CHARAKTER 30
3.3.1.1 MAPC 30
3.3.1.2 MIAMI 31
3.3.1.3 SKP-ZELLEN 31
3.3.1.4 SATELLITENZELLEN UND MUSKELSTAMMZELLEN 32
3.3.1.5 VSEL ZELLEN 32
3.4 HYPOTHESEN 34
3.5 ZIEL DER ARBEIT 34
4 MATERIALIEN & METHODEN 36
4.1 MATERIALIEN 36
4.1.1 CHEMIKALIEN & REAGENZIEN 36
4.1.1.1 ALLGEMEINE CHEMIKALIEN 36
4.1.1.2 OLIGONUKLEOTIDE 36
4.1.1.3 DIREKTKONJUGIERTE ANTIKOERPER 39
1
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4.1.1.4 PRIMAERE ANTIKOERPER 39
4.1.1.5 SEKUNDAERE ANTIKOERPER 39
4.1.2 VERBRAUCHSMATERIALIEN 40
4.1.3 ZELLLINIEN 40
4.1.4 MAUSSTAEMME 40
4.1.5 GERAETE 40
4.2 MOLEKULARBIOLOGISCHE METHODEN 41
4.2.1 MRNA-ISOLIERUNG 41
4.2.2 QRT-PCR 41
4.2.2.1 UMSCHREIBUNG VON MRNA IN CDNA 42
4.2.2.2 QUANTITATIVE PCR 42
4.2.2.3 AUSWERTUNG NACH DER AAOR-METHODE 42
4.2.2.4 AGAROSEGELELEKTROPHORESE 43
4.2.3 IMMUNOCHEMIE & MIKROSKOPIE 44
4.2.3.1 IMMUNOFLUORESZENZFAERBUNG 44
4.2.3.2 HOECHST-FAERBUNG ADHAERENTER ZELLEN 45
4.2.3.3 GERAETE 45
4.2.4 TRANSMISSIONSELEKTRONENMIKROSKOPIE 46
4.2.5 MICROARRAYS 46
4.3 HISTOLOGIE 47
4.3.1 HERSTELLUNG VON ZELLPRESSLINGEN 47
4.3.2 FIXIERUNG VON PRESSLINGEN 47
4.3.3 ENTWAESSERUNG UND EINBETTUNG VON PRESSLINGEN 47
4.3.4 ANFERTIGUNG VON DUENNSCHNITTEN 47
4.3.4.1 MAYERS HAEMATOXYLIN & ERYTHROSIN FAERBUNG 48
4.3.5 ENTPARAFFINIERUNG UND REHYDRATISIERUNG DER DUENNSCHNITTE .... 48
4.3.6 FAERBUNG DER DUENNSCHNITTE 48
4.3.6.1 MASSONS TRICHROM FAERBUNG 49
4.3.6.2 ALCIAN BLAU & NUCLEAR FAST RED FAERBUNG 50
4.3.6.3 SAFRANIN-0 & FAST GREEN FAERBUNG 50
4.3.7 EINBETTUNG DER DUENNSCHNITTE UND MIKROSKOPIE 51
4.4 ZELL- & GEWEBEKULTUR 51
4.4.1 ANZUCHT VON ZELLLINIEN UND PRIMAERZELLEN 51
4.4.2 KULTUR UND EXPANSION VON ADHAERENTEN ZELLEN 51
4.4.2.1 MSC, SL45, MEF, NSC, C2C12 UND NTERA2 51
4.4.2.2 MURINE ESCS 52
4.4.2.3 KRYOKONSERVIERUNG UND AUFTAUEN 52
4.4.2.4 SUBKULTIVIERUNG 53
2
4.4.2.5 BESTIMMUNG DER ZELLDICHTE 53
4.4.2.6 BESCHICHTUNG VON ZELLKULTURGEFAESSEN 53
4.4.2.7 CFU-F EXPERIMENT 54
4.4.3 WACHSTUM UNTER HYPOXISCHEN BEDINGUNGEN 55
4.4.4 KOKULTURSYSTEME 55
4.4.4.1 IMMUNOSUPPRESSION - GEMISCHTE LYMPHOZYTENREAKTION . 55
4.4.5 KULTUR UND EXPANSION VON NEUROSPHAEREN UNTER NICHT-ADHAERENTEN
BEDINGUNGEN 56
4.4.6 ISOLIERUNG VON PRIMAERZELLEN UND -GEWEBEN 57
4.4.6.1 KONVENTIONELLE ZELLISOLATION AUS MURINEM KNOCHENMARK 57
4.4.6.2 ALTERNATIVE ZELLISOLATION AUS MURINEM KNOCHENMARK . . 58
4.4.6.3 ZELLISOLATION AUS DER MILZ 59
4.4.6.4 ZELLISOLATION AUS DEM GEHIRN 59
4.4.6.5 GEWINNUNG VON MEF AUS MAUSEMBRYOS 60
4.4.7 ZELLZYKLUSARRETIERUNG EXPANDIERENDER ZELLEN 61
4.4.7.1 Y-BESTRAHLUNG . 61
4.4.7.2 MITOMYCIN-C-BEHANDLUNG 61
4.4.8 FIXIERUNG IN SUSPENSION 61
4.4.9 FIXIERUNG VON ADHAERENTEN ZELLEN 61
4.4.9.1 FIXIERUNG MIT PFA 61
4.4.9.2 FIXIERUNG MIT METHANOL 62
4.4.10 MACS 62
4.4.11 FACS-ANALYSE 63
4.4.11.1 HOECHST-FAERBUNG IN SUSPENSION 63
4.4.11.2 PROPIDIUMIODID-FAERBUNG IN SUSPENSION 64
4.4.12 FACS-SORT 64
4.4.13 ENTFERNUNG VON ERYTHROZYTEN AUS ZELLSUSPENSIONEN 65
4.4.13.1 FICOLL-PRAEPARATION ZUR GEWINNUNG VON MNC 65
4.4.13.2 HYPOTONISCHE LYSE MIT WASSER ZUR GEWINNUNG VON TNC 65
4.4.13.3 AMMONIUMCHLORID VERMITTELTE LYSE ZUR GEWINNUNG VON
TNC 66
4.4.14 DIFFERENZIERUNGESMETHODEN UND DETEKTION DER DIFFERENZIERUNGEN 66
4.4.14.1 CHONDROGEN 66
4.4.14.2 OSTEOGEN 67
4.4.14.3 ADIPOGEN 67
4.4.14.4 NEUROGEN 68
4.4.14.5 HEPATOZYTAER 68
4.4.14.6 HEMATOPOETISCH - CFC-ASSAY 70
3
4.5 BIOINFORMATIK & STATISTIK 70
4.5.1 R / BIOCONDUCTOR 70
4.5.2 MEV 70
4.5.3 VIRTUALARRAY 70
4.5.4 CYTOSCAPE 73
4.5.5 GNUPLOT 73
5 ERGEBNISSE 74
5.1 ANREICHERUNG VON MSTRC BZW. CFU-F IN SUBFRAKTIONIERUNGEN VON MURI
NEM KNOCHENMARK 74
5.1.1 AUSWERTUNG VON CFU-F EXPERIMENTEN 75
5.1.2 DIFFERENZIERUNG EXPANDIERTER CFU-F 75
5.1.3 VERTEILUNG VON CFU-F IN SUBFRAKTIONIERUNGEN VON MURINEM KNO
CHENMARK 76
5.2 PROSPEKTIVE ISOLIERUNG VON CFU-F 80
5.3 LANGZEITKULTUREN VON SL45 ZELLEN SIND FGF2-ABHAENGIG 82
5.4 SL45 ZELLEN ALS POPULATION MULTIPOTENTER MSTRC 84
5.4.1 MARKERGENE MINDESTENS DREIER MESENCHYMALER LINIEN SIND IN SL45
ZELLEN UEBEREXPRIMIERT GEGENUEBER MESENCHYMALEN STROMAZELLEN . . 85
5.4.2 SL45 ZELLEN EXPRIMIEREN NESTIN AUF PROTEINEBENE 86
5.4.3 SL45 ZELLEN EXPRIMIEREN PDGFRA AUF PROTEINEBENE 87
5.5 PROGENITOREN UND STAMMZELLEN WERDEN DURCH ALTERUNG ABGEREICHERT ...
88
5.6 STAMMZELLEN UND PROGENITOREN SIND SENSITIV GEGENUEBER HOHEN
SAUERSTOFF
KONZENTRATIONEN 90
5.6.1 MESENCHYMALE CFU-F UND HAEMATOPOETISCHE CFC 90
5.6.2 SL45 ZELLEN 91
5.7 MESENCHYMALE VORLAEUFER SIND STARK MIT DER KNOCHENMATRIX ASSOZIIERT .
. 91
5.7.1 CFU-F BZW. MSTRC 94
5.7.2 SL45 ZELLEN 95
5.8 VERGLEICH VON SL45 ZELLEN MIT VSEL ZELLEN 96
5.8.1 UNTERSUCHUNGEN ZUR EINSCHAETZUNG DER PLURIPOTENZ VON SL45 BZW.
VSEL ZELLEN 98
5.8.1.1 SL45 ZELLEN EXPRIMIEREN WEDER OCT4 NOCH NANOG .... 99
5.8.1.2 SL45 BZW. VSEL ZELLEN ZEIGEN KEIN WACHSTUM IN ESC-
BEDINGUNGEN 99
5.8.2 SL45 ZELLEN SIND KLEINER ALS LYMPHOCYTEN 99
5.8.3 UNTERSCHIEDE IN DER ULTRASTRUKTUR UND DER ZELLKERNSTRUKTUR VON
SL45 ZELLEN IM VERGLEICH ZU LYMPHOZYTEN 102
4
5.9 NICHTMESENCHYMALE DIFFERENZIERUNGEN 104
5.9.1 NEURONAL 104
5.9.1.1 NICHT-KULTIVIERTE SL45 ZELLEN EXPRIMIEREN MARKER DER
NEURALLEISTE 104
5.9.1.2 EXPONENTIELL WACHSENDE SL45 ZELLEN EXPRIMIEREN NESTIN
UND TUJL 106
5.9.1.3 NEURONAL DIFFERENZIERTE SL45 ZELLEN EXPRIMIEREN NESTIN,
TUJL UND MAP2 106
5.9.1.4 ADHAERENDE ZELLEN KOENNEN IN SPHAEREN UEBERFUEHRT WERDEN 106
5.9.1.5 SPHAEREN AUS SL45 ZELLEN EXPRIMIEREN NESTIN UND MAP2 109
5.9.1.6 DIFFERENZIERTE SPHAEREN AUS SL45 ZELLEN EXPRIMIEREN NES
TIN, TUJL UND S100 110
5.9.1.7 ZUSAMMENFASSUNG DER NEURONALEN DIFFERENZIERUNG . . . 111
5.9.2 HEPATOZYTAER 111
5.10 SL45 ZELLEN BESITZEN IMMUNOSUPPRESSIVE EIGENSCHAFTEN 113
5.11 TRANSKRIPTOMANALYSEN MIT HILFE VON MICROARRAYS 113
5.11.1 VEREINIGUNG UNABHAENGIGER DATENSAETZE MIT VIRTUALARRAY 115
5.11.2 TRANSKRIPTOM VON SL45 ZELLEN 118
5.11.3 TRANSKRIPTOM HUMANER VSEL ZELLEN 124
6 DISKUSSION 128
6.1 ISOLATION MURINER CFU-F UND PUTATIVER MSC 129
6.2 UEBERSCHNEIDUNG PUTATIVER MSC POPULATIONEN 131
6.2.1 PAS MSC 131
6.2.2 NESTIN+ MSC 131
6.2.3 NCSC ! 132
6.2.4 SYNTHESE 132
6.2.5 SL45 ZELLEN ALS PUTATIVE MSC 133
6.2.5.1 KEIMBLATTUEBERGREIFENDES DIFFERENZIERUNGSPOTENTIAL . . . 134
6.2.5.2 EXPRESSION DES NESTIN-PROTEINS 134
6.2.5.3 HYPOXIE UND IN VIVO LOKALISIERUNG VON MSC 134
6.2.5.4 SENESZENZ VON SL45 ZELLEN UND FGF2-ABHAENGIGKEIT . . 135
6.2.5.5 NEURAILEISTENIDENTITAET PUTATIVER MSC 136
6.3 SL45 ZELLEN BESITZEN GEMEINSAMKEITEN SOWIE UNTERSCHIEDE ZU KUCIA ET
ALIIS VSEL ZELLEN 139
6.4 AUSBLICK 142
7 ANHANG 144
5
8 ABKUERZUNGEN 169
9 LITERATUR 173
10 LEBENSLAUF 201
11 PUBLIKATIONSVERZEICHNIS &. ECTS 202
6
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