Verfügbarkeit: Genetische Ursachen des MRKH-Syndroms und Fusionsanomalien der Müllerschen Gänge

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Bibliographische Detailangaben
Titel:	Genetische Ursachen des MRKH-Syndroms und Fusionsanomalien der Müllerschen Gänge
Von:	Ann-Christin Tewes
Person:	Tewes, Ann-Christin 1986- Verfasser aut
Hauptverfasser:	Tewes, Ann-Christin 1986- (VerfasserIn)
Format:	Hochschulschrift/Dissertation Buch
Sprache:	Deutsch
Veröffentlicht:	Münster 2017
Schlagwörter:	Müllerscher Gang Genetik Missbildung Hochschulschrift
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adam_text	INHALTSVERZEICHNIS KAPITEL 1 EINLEITUNG........................................................................................................... 1 1.1 WEIBLICHE STERILITAET UND INFERTILITAET.................................................................................. 1 1.2 WEIBLICHE GENITALE FEHLBILDUNGEN................................................................................... 1 1.3 KLASSIFIKATION DER WEIBLICHEN GENITALEN FEHLBILDUNGEN .................................................. 2 1.4 MAYER-ROKITANSKY-KUESTER-HAUSER-SYNDROM...................................................................4 1.4.1 ASSOZIIERTE FEHLBILDUNGEN.........................................................................................6 1.5 SYNDROMALE ERKRANKUNGEN, WELCHE MIT MALFORMATIONEN DER .......................................... 7 MUELLERSCHEN GAENGE EINHERGEHEN.....................................................................................7 1.6 EMBRYOLOGIE UND GENETIK DER GENITALENTWICKLUNG ......................................................... 9 1.7 GENETIK DES MRKH-SYNDROMS UND DER FUSIONSSTOERUNGEN DER......................................12 MUELLERSCHEN GAENGE........................................................................................................ 12 1.8 ZIELSETZUNG.....................................................................................................................18 KAPITEL 2 MATERIAL UND METHODEN....................................................................................... 19 2.1 MATERIALIEN...................................................................................................................19 2.1.1 CHEMIKALIEN............................................................................................................ 19 2.1.2 ENZYME...................................................................................................................21 2.1.3 READY TO USE (KITS).................................................................................................21 2.1.4 PRIMER......................................................................................................................22 2.1.5 PATIENTEN..................................................................................................................22 2.1.6 GROESSEN- UND MOLEKULARGEWICHTSMARKER................................................................. 22 2.1.7 ANTIKOERPER...............................................................................................................23 2.1.8 PLASMIDE..................................................................................................................23 2.1.9 BAKTERIENSTAEMME.....................................................................................................24 2.1.10 ZELLLINIE.................................................................................................................24 2.1.11 MEDIEN UND AGAR- PLATTEN.....................................................................................24 2.1.12 ZELLKULTUR.............................................................................................................. 25 2.1.13 PUFFER.................................................................................................................... 25 2.1.14 ONLINE DATENBANKEN UND PROGRAMME................................................................... 27 2.1.15 GERAETE................................................................................................................... 28 2.2 METHODEN..................................................................................................................... 30 2.2.1 MOLEKULARBIOLOGISCHE METHODEN - ARBEITEN MIT DNA ....................................... 30 2.2.1.1 AMPLIFIKATION GENOMISCHER DNA........................................................................ 30 2.2.1.2 DNA-KONZENTRATIONSBESTIMMUNG.......................................................................30 2.2.1.3 PRIMERDESIGN....................................................................................................... 31 2.2.1.4 POLYMERASE-KETTENREAKTION (POLYMERASE CHAIN REACTION, PCR) .......................... 32 2.2.1.5 AGAROSE-GELELEKTROPHORESE..................................................................................33 2.2.1.6 AUFREINIGUNG DER PCR-PRODUKTE..........................................................................34 2.2.1.7 SEQUENZIERUNG NACH SAENGER ................................................................................ 34 2.2.1.8 AUFREINIGUNG DER SEQUENZIERUNGS-PRODUKTE MITTELS GEL-PERMEATIONS- ............... 35 CHROMATOGRAPHIE (GPC)......................................................................................35 2.2.1.9 AUFTRENNUNG UND DETEKTION DER SEQUENZEN MITTELS KAPILLARELEKTROPHORESE ....... 36 2.2.1.10 ANALYSE DER SEQUENZDATEN................................................................................. 36 2.2.1.11 KLONIERUNG VON DNA-FRAGMENTEN .................................................................... 37 2.2.1.11.1 RESTRIKTIONSSPALTUNG VON DNA....................................................................... 37 2.2.1.11.2 AUFREINIGUNG DURCH GEL-EXTRAKTION ................................................................ 37 2.2.1.11.3 EIGATION VON DNA-FRAGMENTEN...................................................................... 38 2.2.1.11.4 MUTAGENESE (SITE DIRECTED MUTAGENESIS) ......................................................... 38 2.2.2 MOLEKULARBIOLOGISCHE METHODEN - ARBEITEN MIT RNA.........................................40 2.2.2.1 ISOLIERUNG VON TOTAL-RNA AUS HEK-293 ZELLEN.................................................40 2.2.22 RNA-KONZENTRATIONSBESTIMMUNG UND QUALITAETSKONTROLLE MITTELS .......................... TAPESTATION..........................................................................................................41 2.2.2.3 RNA-PANEL-ANALYSE MITTELS NEXT GENERATION SEQUENCING .................................. 41 2.2.2.3 AUSWERTUNG DER RNA-PANEL-ANALYSE..................................................................44 2.2.3 MIKROBIOLOGISCHE METHODEN.................................................................................... 45 2.2.3.1 TRANSFORMATION VON KOMPETENTEN BAKTERIEN (E.COLI) ..........................................45 2.2.3.2 ISOLIERUNG VON PLASMID-DNA AUS BAKTERIEN (E.COLI) ...........................................45 2.2.4 ZELLBIOLOGISCHE METHODEN........................................................................................ 47 2.2.4.1 EINFRIEREN UND AUFTAUEN VON EUKARYOTISCHEN ZELLEN ........................................... 47 2.2.4.2 ZELLZUCHT............................................................................................................. 47 2.2.4.3 BESTIMMUNG DER ZELLZAHL.....................................................................................48 2.2.4.4 TRANSIENTE TRANSAKTION.......................................................................................48 2.2.4.5 ZELLEMTE...............................................................................................................48 2.2.5 PROTEINBIOCHEMISCHE METHODEN .............................................................................. 49 2.2.5.1 PROTEINEXTRAKTION AUS ZELLLYSAT.............................................................................49 2.2.5.2 BESTIMMUNG DER PROTEINKONZENTRATION................................................................ 49 2.2.5.3 SDS-POLYACRYLAMID-GELELEKTROPHORESE............................................................... 50 2.2.5.4 WESTEM-BLOT........................................................................................................51 2.2.5.5 IMMUNODETEKTION VON IMMOBILISIERTEN PROTEINEN ................................................ 51 2.2.5.6 STATISTISCHE AUSWEITUNG..................................................................................... 52 KAPITEL 3 ERGEBNISSE.............................................................................................................. 53 3.1 SEQUENZANALYSEN.......................................................................................................... 53 3.1.1 SEQUENZANALYSE DES GENS BMPR1B....................................................................... 53 3.1.2 SEQUENZANALYSE DES GENS GDF6............................................................................ 54 3.1.3 SEQUENZANALYSE DES GENS KIF24............................................................................ 55 3.1.4 SEQUENZANALYSE DES GENS PAX2............................................................................. 58 3.1.5 SEQUENZANALYSE DES GENS RBM8A.......................................................................... 59 3.1.6 SEQUENZANALYSE DES GENS SNAP29......................................................................... 61 3.1.7 SEQUENZANALYSE DES GENS TBX6............................................................................. 62 3.1.8 SEQUENZANALYSE DES GENS WNT9B.......................................................................... 64 3.2 FUNKTIONELLE ANALYSEN................................................................................................. 66 3.2.1 KLONIERUNG DER LHX1- SOWIE WNT9B- WILDTYPSEQUENZ........................................67 3.2.2 LHX1 MUTAGENESE AUF DEN PEGFP-N3-L//X7 VEKTOR..............................................68 3.2.3 WNT9B MUTAGENESE AUF DEN PEGFP-N3-W79 VEKTOR ...................................... 70 3.2.4 WESTERN-BLOT ANALYSEN........................................................................................... 71 3.2.4.1 NACHWEIS VON EXPRESSIONSUNTERSCHIEDEN ZWISCHEN DEM WNT9B-WT .................. UND DEN WNT9B-MUTANTEN................................................................................. 73 3.2.4.2 AUSWIRKUNG DES WNT9B-WT IM VERGLEICH ZU DEN WNT9B-MUTANTEN ................ AUF DIE EXPRESSION VON WNT4, PAX2 UND PAX8 ............................................. 74 3.2.4.3 NACHWEIS VON EXPRESSIONSUNTERSCHIEDEN ZWISCHEN DEM LHX1-WT ...................... UND DEN LHX1-MUTANTEN..................................................................................... 77 3.2.4.4 AUSWIRKUNG DES LHX1-WT IM VERGLEICH ZU DEN LHX1-MUTANTEN........................ AUF DIE EXPRESSION VON WNT4, PAX2 UND PAX8.................................................79 3.3 FOKUSSIERTE TRANSKRIPTOMANALYSE.............................................................................. 81 3.3.1 QUALITAETSKONTROLLE MITTELS TAPESTATION .................................................................... 81 3.3.2 AUSWIRKUNG DES EXOGENEN WNT9B-WT SOWIE DER MUTANTEN AUF DIE....................... TRANSKRIPTIONSRATE ASSOZIIERTER GENE ....................................................................... 83 3.3.2 AUSWIRKUNG DES EXOGENEN LHX1-WT SOWIE DER MUTANTEN AUF DIE........................... TRANSKRIPTIONSRATE ASSOZIIERTER GENE....................................................................... 86 KAPITEL 4 DISKUSSION.............................................................................................................. 89 4.1 SEQUENZANALYSEN........................................................................................................89 4.1.1 SEQUENZANALYSE DES GENS BMPR1B....................................................................... 90 4.1.2 SEQUENZANALYSE DES GENS GDF6............................................................................ 91 4.1.3 SEQUENZANALYSE DES GENS K1F24............................................................................ 93 4.1.4 SEQUENZANALYSE DES GENS PAX2............................................................................ 95 4.1.5 SEQUENZANALYSE DES GENS RBM8A.......................................................................... 96 4.1.6 SEQUENZANALYSE DES GENS SNAP29......................................................................... 97 4.1.7 SEQUENZANALYSE DES GENS TBX6............................................................................99 4.1.8 SEQUENZANALYSE DES GENS WNT9B.........................................................................102 4.1.9 ANALYSE DES GESAMTEN KOLLEKTIVS AUF GEN UEBERGREIFENDE ERGEBNISSE ................... 103 4.2 FUNKTIONELLE ANALYSEN............................................................................................... 105 4.2.1 NACHWEIS VON EXPRESSIONSUNTERSCHIEDEN ZWISCHEN DEM WNT9B-WT ...................... UND DEN WNT9B-MUTANTEN...................................................................................106 4.2.2 AUSWIRKUNG VON WNT9B-WT IM VERGLEICH ZU DEN WNT9B-MUTANTEN................... AUF DIE EXPRESSION VON WNT4, PAX2 UND PAX8.................................................107 4.2.3 NACHWEIS VON EXPRESSIONSUNTERSCHIEDEN ZWISCHEN DEM LHX1-WT UND................... LHX1-MUTANTEN.................................................................................................... 108 4.2.4 AUSWIRKUNG VON LHX1- WT IM VERGLEICH ZU DEN LHX1-MUTANTEN ......................... AUF DIE EXPRESSION VON WNT4, PAX2 UND PAX8.................................................113 5.3 FOKUSSIERTE TRANSKRIPTOMANALYSE ............................................................................ 114 5.3.1 AUSWIRKUNG DES EXOGENEN WNT9B-WT SOWIE DER MUTANTEN AUF DIE .................. 114 TRANSKRIPTIONSRATE ASSOZIIERTER GENE......................................................................114 5.3.2 AUSWIRKUNG DES EXOGENEN LHX1-WT SOWIE DER MUTANTEN AUF DIE ...................... 121 TRANSKRIPTIONSRATE ASSOZIIERTER GENE......................................................................121 KAPITEL 5 SCHLUSSFOLGERUNG................................................................................................. 125 KAPITEL 6 AUSBLICK............................................................................................................... 127 KAPITEL 7 LITERATURVERZEICHNIS........................................................................................... 128 KAPITEL 8 APPENDIX.................................................................................................................. I ABBILDUNGSVERZEICHNIS.........................................................................................................XXI T ABELLEN VERZEICHNIS............................................................................................................ XXII DANKSAGUNG....................................................................................................................... XXIII EIDESSTATTLICHE ERKLAERUNG...................................................................................................XXIV LEBENSLAUF.......................................................................................................................... XXV
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